Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, д. 86.

Предложено использовать метод высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара летучих производных аминокислот для оценки уровня включения стабильных изотопов дейтерия D  и углерода 13С в молекулы мультикомпонентных смесей секретируемых аминокислот L-фенилаланинпродуцирующего штамма Brevibacterium methylicum и L-лейцинпродуцирующего штамма Methylobacillus  flagellatum и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы при выращивании бактерий на средах, содержащих в качестве источников стабильных изотопов (D)метанол, (13С)метанол и тяжёлую воду. Метод также апробирован для исследования включения L-[2,3,4,5,6-D]фенилаланина, L-[3,5-D]тирозина и L-[2,4,5,6,7-D]триптофана в мембранный белок бактериородопсин, синтезируемый Halobacterium halobium ЕТ 1001. Предложенный метод заключается в прямой обработке мультикомпонентных смесей аминокислот в составе лиофилизованных культуральных жидкостей и белковых гидролизатов (гидролиз в 6 М DСl (3% фенол) и 2 М гидроокиси бария) N-диметиламинонафталин-5-сульфонил-хлоридом (дансилхлоридом) (и N-бензилоксикарбонил-хлоридом) и диазометаном в метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонил (дансил)- и N-бензилоксикарбонил- производных аминокислот, которые препаративно разделеляли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Метод меченных атомов (D, 13С, 15N и другие) является важным современным подходом в многочисленных биохимических и метаболических исследованиях с использованием аминокислот и других биологически активных соединений [1]. Молекулы аминокислот, полученных с помощью этого метода широко применяются для изучения пространственной структуры и конформационных изменений белков [2], взаимодействия белковых молекул [3], а также в химических синтезах изотопно-меченых соединений на их основе [4]. Для этих исследований необходимо осуществлять чёткий контроль за уровнем включения стабильных изотопов в молекулы, который может осуществляться разными методами, включая ЯМР, ИК-спектроскопию и масс-спектрометрию.

Идея является продолжением наших исследований [5-15], направленных на биосинтетическое получение [D]- и [13С]аминокислот за счёт утилизации низкомолекулярных меченых субстратов - (D)метанола, (13С)метанола и тяжёлой воды в клетках микроорганизмов и разработку лёгкого и удобного метода оценки изотопного включения молекул мультикомпонентных смесей аминокислот методом масс-спектрометрии электронного удара. Чувствительность масс-спектрометрии составляет 10-9-10-11 нмоль, что существенно выше, чем при использовании ИК- и ЯМР-спектроскопии. Предлагается использовать метод масс-спектрометрии электронного удара в сочетании с обращённо-фазовой ВЭЖХ для исследования уровня изотопного обогащения молекул аминокислот в составе их сложных мультикомпонентных смесей, каковыми являются препараты культуральных жидкостей штаммов-продуцентов аминокислот и гидролизаты белков, полученные со сред, содержащих стабильные изотопы.

Объектами исследования служили полученные в результате мутагенеза L-фенилаланинпродуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, ассимилирующий метанол по рибулозо-5-монофосфатному пути фиксации углерода, и L-лейцинпродуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum, реализующий 2-кето-3-дезоксиглюконатальдолазный вариант рибулозо-5-монофосфатного пути фиксации углерода. Для компенсации ауксотрофности по L-лейцину и L-изолейцину эти аминокислоты добавляли в ростовые среды в протонированном виде. При этом уровни накопления L-фенилаланина и L-лейцина в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов достигали величины 0.8 и 1.0 г/л соответственно. Включение дейтерия в молекулы секретируемых аминокислот и суммарных белков биомассы осуществляли за счёт выращивания штамма B. methylicum на средах с тяжёлой водой и обычным метанолом, так как уровень включения дейтерия в молекулы аминокислоты за счёт ассимиляции (D)метанола незначителен. Выращивание метилотрофных бактерий B. methylicum и M. flagellatum осуществляли на минеральной среде М9 в колбах Эрленмейера объёмом 250 мл с наполнением средой 50 мл по разработанной нами методике [10], используя в качестве источников стабильных изотопов (D)метанол, (13С)метанол и тяжёлую воду в присутствии L-лейцина для B. methylicum и L-изолейцина для M. flagellatum в концентрациях 10 мг/л.

В качестве другой модельной системы для включения изотопной метки в молекулы белков, использовали мембранный белок бактериородопсин [11], синтезируемый в мембране Halobacterium halobium ЕТ 1001. Выбор для этих целей бактериородопсина, функционирующего как АТP-зависимая транслоказа в клетках галофильных бактерий, был продиктован возможностью исследования с его помощью процессов функционирования мембранных белков in vivo в условиях изотопного обогащения среды дейтерием. Для включения дейтериевой метки в молекулу бактериородопсина использовали метод селективного обогащения белка за счёт выращивания H. halobium ЕТ 1001 на синтетической среде с дейтерийсодержащими аналогами ароматических аминокислот -L-[2,3,4,5,6-D]фенилаланином, L-[3,5-D]тирозином и L-[2,4,5,6,7-D]триптофаном.

Основные этапы реализации этой идеи заключались в выращивании штаммов-продуцентов на средах с мечеными субстратами - (D)метанолом, (13С)метанолом и D2О или L-[2,3,4,5,6-D]фенилаланином, L-[3,5-D]тирозином и L-[2,4,5,6,7-D]триптофаном (бактериородопсин), отделении культуральных жидкостей, содержащих секретируемые аминокислоты, от микробной биомассы, разрушении клеток, выделении фракции суммарных белков биомассы и бактериородопсина с последующим их гидролизом, дериватизации смесей аминокислот дансилхлоридом, бензилоксикарбонилхлоридом и диазометаном, разделении метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот и N-Cbz-производных аминокислот методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, масс-спектрометрии электронного удара полученных производных аминокислот. 

D- и 13C-Содержащие аминокислоты анализировали из лиофилизованных культуральных жидкостей штаммов-продуцентов аминокислот B. methylicum и M. flagellatum, а также в составе гидролизатов суммарных белков биомассы. При выделении фракции  суммарных  белков  необходимо учитывать  наличие в них углеводов, липидов и пигментов. Использовались богатые по белку штаммы бактерий со сравнительно небольшим содержанием углеводов в них. Гидролизу в качестве фракции суммарных белков биомассы подвергали остаток биомассы после отделения липидов и пигментов экстракцией органическими растворителями (метанол-хлороформ-ацетон). В редких случаях для полного отделения от сопутствующих компонентов прибегали к солюбилизации белков в SDS или высаливании их сульфатом аммония.

Выделение и очистку индивидуальных белков для этих целей целесообразно осуществлять методом солюбилизации с использованием подходящих детергентов, что особенно важно для бактериородопсина, являющегося высокоспиральным белком. Поэтому при выделении бактериородопсина из пурпурных мембран галофильной бактерии H. halobium ЕТ 1001 мы солюбилизовали его в 0.5% растворе SDS с сохранением a-спиральной конфигурации белка, а далее осаждали его метанолом. Гомогенность очищенного бактериородопсина была подтверждена электрофорезом в 12.5% ПААГ в присутствии 0.1% SDS.

В соответствии с целью исследования мы проводили гидролиз дейтерий-меченных белков биомассы кислотным и щелочным гидролизом. Для получения дейтерированных аминокислот из белка микроорганизмов целесообразнее использовать гидролиз в 6МDСl (24 ч, 1100С) в тяжёлой воде (в присутствии добавки фенола для сохранения ароматических аминокислот), чтобы предотвратить рацемизацию аминокислот в ходе гидролиза. Для изучения уровня включения стабильных изотопов в остатки ароматических кислот бактериородопсина и в аналитических целях целесообразнее применять гидролиз белка в 2-М-ном растворе гидроокиси (1100 C, 24 ч) бария, при котором отсутствует (Н-D)-обмен в аминокислотах и сохраняются остатки фенилаланина, тирозина и триптофана. Возможная рацемизация аминокислот при елочном гидролизе не влияет на результат последующего масс-спектрометрического определения уровней включения дейтерия в аминокислоты.

Для получения летучих производных аминокислоты переводили в метиловые эфиры N-Dns-аминокислот или N-Cbz-аминокислоты, которые затем разделяли  методами обращенно-фазовой ВЭЖХ. Условия N-модификации аминокислот отрабатывали таким образом, чтобы получить в масс-спектрах как можно более интенсивные пики их молекулярных ионов М+. на уровне фона метаболитов среды. Для этого мы проводили прямую дериватизацию аминокислот в составе лиофилизованных культуральных жидкостей, содержащих метаболиты и примеси и гидролизатов суммарных белков биомассы пятикратным избытком дансилхлорида или бензилоксикарбонилхлорида по следующим разработанным нами методикам.

Методика получения N-Dns-аминокислот: К 4-5 мг лиофилизованных препаратов культуральной жидкости и белковых гидролизатов в 1 мл 2 М NaHCO3 (рН 9-10) порциями при перемешивании добавляли 25.6 мг дансилхлорида в 2 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при перемешивании при 400 С, затем подкисляли 2 М HСl до рН 3.0 и экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.

Методика получения N-Cbz-аминокислот: К 1.5 мл охлажденного до 00С раствора культуральной жидкости (50 мг) или белковых гидролизатов (4-5 мг) в 4 М NaOH добавляли порциями при перемешивании 2 мл 4 М NaOH и 28.5 мг бензилоксикарбонилхлорида. Реакционную смесь выдерживали при 00С, перемешивали 3 ч, подкисляли 2 М HCl до рН 3 и продукты экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.

Методика получения метиловых эфиров  N-Dns-аминокислот: Для получения диазометана к  20 мл 40% КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После окончания интенсивного газовыделения  эфирный слой отделяли, промывали ледяной водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки препаратов N-дансиламинокислот в составе культуральной жидкости или гидролизатов суммарных белков биомассы.

При модификации аминокислот этими реагентами для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными образовывались ди-Dns и ди-Cbz-производные. Кроме этого, из аргинина синтезировался N-три-Dns-(Cbz)-аргинин. Поэтому в масс-спектрометрических исследованиях молекулярные ионы М+. этих соединений соответствовали ди- или три- производным.

Эффективность использования N-Cbz-производных аминокислот в обращённо-фазовой ВЭЖХ и в масс-спектрометрических исследованиях была показана нами ранее [12-16]. Но всё же эти производные не достаточно летучи. Летучесть N-производных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе может быть повышена за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе, поэтому N-Dns-аминокислоты были переведены в их метиловые эфиры. Для предотвращения обратного изотопного обмена ароматических протонов (дейтеронов) при этерификации дейтериймеченых аминокислот, мы отдали предпочтение использованию диазометана для этих целей. Свежеприготовленным раствором диазометана в диэтиловом эфире обрабатывали сухие остатки смесей аминокислот. При дериватизации аминокислот диазометаном происходило дополнительное N-метилирование по a-NH-(Dns)-группе аминокислот, что приводило к появлению в масс-спектрах метиловых эфиров N-Dns-аминокислот дополнительных пиков, соответствующих соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных.

Для изучения включения изотопов дейтерия и 13С в молекулы аминокислот мультикомпонентных смесей в составе культуральных жидкостей и белковых гидролизатов использовали масс-спектрометр MB-80 A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ. Затем метиловые эфиры N-Dns-производных аминокислот N-Cbz-производные аминокислот препаративного разделяли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Knauer, УФ-детектором 2563 и  интегратором С-R 3A (Shimadzu, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C18; 18.7 мкм; 150 x3.3 мм (Kova, Чехо-Словакия); система растворителей: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота, (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали градиентное элюирование: от 0 до 20% В 5 мин, 20 до 100% В 30 мин, 100% В 5 мин, от 100 до 0% В 2 мин, 0% В 10 мин. Степени хроматографической чистоты 2Н- и 13С-содержащих аминокислот, выделенных из культуральных жидкостей B. methylicum и M. flagellatum и гидролизатов белков в виде их N-Cbz-производных аминокислот составили 96-98%, при выходах - 67-89%. Для отдельных аминокислот оказалось более удобным разделение в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот. При этом степень хроматографической чистоты полученных из гидролизатов бактериородопсина метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина, N-Dns-тирозина и N-Dns-триптофана составили 96, 97 и 98% соответственно. Данный результат важен потому, что именно метиловые эфиры N-Dns-аминокислот вследствие своей химической стабильности, наличия высокоинтенсивных молекулярных ионов М+. при высоких молекулярных массах оказались весьма удобными для масс-спектрометрических исследований и позволяют идентифицировать аминокислоты в присутствии низкомолекулярных метаболитов среды и других продуктов дериватизации. Последний факт очень важен для изучения сложного состава пула аминокислот, секретируемых в культуральные жидкости штаммов-продуцентов.

Пути фрагментации метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина и N-Dns-лейцина при использовании предложенного метода масс-спектрометрии электронного удара приводили к формированию пиков их молекулярных ионов при m/z 412 и m/z 378 и к образованию дансильных фрагментов и продуктов их дальнейшего распада до N-диметиламинонафталина, а также к получению аминных А+ и аминоацильных фрагментов В+. Причём именно тот факт, что фрагментация метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина и N-Dns-лейцина характерна для этих производных всех других аминокислот, что позволяет проводить масс-спектрометрический мониторинг изотопно-меченых аминокислот в составе интактных культуральных жидкостей штаммов-продуцентов, содержащих сумму аминокислот и других метаболитов среды, до стадии их хроматографического разделения, а также исследовать включение стабильных изотопов в аминокислоты белковых гидролизатов.

Общие принципы этой идеи были продемонстрированы на примере анализа сложных мультикомпонентных смесей, полученных после гидролиза суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий, а также индивидуального белка – бактериородопсина, выполняющего роль АТФ-зависимой транслоказы в клетках галофильной бактерии Halobacterium halobium. Как показали наши исследования, до десяти аминокислот могут быть идентифицированы в гидролизате белка B. methylicum по пикам молекулярных ионов метиловых эфиров их N-Dns-производных аминокислот.

Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, пики М+.  гидролизата биомассы соответствовали смесям изотопно-замещённых форм аминокислот. Для лизина и тирозина пики М+. соответствовали метиловым эфирам ди-производных аминокислот - a, e-ди-Dns-лизину (с М+. при m/z 631.0) и О, N-ди-Dns-тирозину (с М+. при m/z 663.9).

Разработанный нами подход показал хорошие результаты по изучению введения дейтериевой метки в молекулу мембранного белка бактериородопсина, выращенного на среде, содержащей L-[2,3,4,5,6-D]фенилаланин, L-[3,5-D]тирозин и L-[2,4,5,6,7-D]триптофан. В масс-спектре дериватизованного гидролизата бактериородопсина детектируются пики, соответствующие  молекулярным ионам обогащённых дейтерием метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина с молекулярным ионом при m/z 417 (ср. m/z 412 для немеченого производного фенилаланина), N-Dns-тирозина с М+. при m/z 429 (ср. m/z 428 для производного тирозина) и N-Dns-триптофана с М+. при m/z 456 (ср. m/z 451 для производного триптофана). Все они отвечают смеси изотнопно-замещённых форм аминокислот, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Множественный характер включения дейтерия свидетельствует о возможном вкладе биосинтеза de novo в уровни дейтерированности ароматических аминокислот, но также не исключено, что он определяется самим способом получения изотопномеченых молекул. Кроме вышеобозначенных аминокислот в масс-спектре фиксируются пики молекулярных ионов метиловых эфиров -N-Dns-глицина (m/z 322), N-Dns-аланина (m/z 336), N-Dns-валина (m/z 364) и N-Dns-лейцина/изолейцина (m/z 378) и других не дейтерированных аминокислот, что подтверждает селективность мечения.

Таким образом, проведённые исследования продемонстрировали эффективность идеи использовать масс-спектрометрию электронного удара N-Cbz-производных аминокислот и метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот для исследования уровней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе их сложных мультикомпонентных смесей, полученных биосинтетически с использованием микроорганизмов. Разработанный нами метод прямой обработки смесей аминокислот в составе культуральной жидкости и гидролизатов биомассы N-бензилоксикарбонил-хлоридом и/или N-диметиламинонафталин-5-сульфонил-(дансил)-хлоридом и диазометаном незаменим для масс-спектрометрического изучения суммарного пула аминокислот, секретируемых в культуральные жидкости штаммов-продуцентов, выращенных на средах со стабильными изотопами.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

2. Redfield C. , Dobson C. M. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 122-136.

3. Zuiderweg E. R. P., McIntosh L. P., Dahlquist F. W., Fesik S. W. // J. Magn. Reson. 1986.  V. 2. P. 210-216.

4. Hruby  V. J. // J. Synth. and Appl. Isot. Labelled Compounds. 1985. V. 4. P. 287-292.

5. Mosin O. V., Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. // Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labelled amino acids. Proc. 7th Int. Symp. Genetics of Industrial Microorganisms. - Quebec. Canada. - 26 June 1994. - P. 163.

6. Mosin O. V., Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. // Preparation of 2H- and 13C-amino acids via bioconvertion of C1-substrates. Proc 8th Int. Symp. Microb. Growth on C1-Compounds. - San Diego. U.S.A. - 27 August 1995. - P. 80.

7. Karnaukhova E. N., Mosin O. V., Reshetova O. S. // Amino Acids. - 1993. - V. 5. - P. 125.

8. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Ерёмин С. В., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 5. -  С. 14-20.

9. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 3. - С. 3-12.

10. Мосин О. В., Егорова Т. А., Складнев Д. А., Швец B. И. // Биоорганическая химия. -  1996. - Т. 22. -  N 10-11. - С. 861-874.  

11. Мосин О. В. Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н (D) и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения. Автореф. дис. канд. хим. наук. М.: МИТХТ им. М. В. Ломоносова. - 1996. - С. 3-23.

12. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. А., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. -  N 4. - С. 27-34.

13. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. - 1993. - N 9. - С. 16-20.

14. Mosin O.V., Skladnev D. A., Svets V.I. Bioscience, biotecnnology and biochemistry 1998.

16. Skladnev D. A., Tsygankov Y. D. // Conversion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass. Proc. 6 th Eur. Conf. on Biomass for Energy. -  Athens. -  Greece. -  22-26 April. -  1991. - P. 234.

16. Егорова Т. А., Еремин С.В , Мосин О. В., Мицнер Б.И, Звонкова Е.. Н., Швец В.И. Биотехнология. - 1993. - N 5. - С. 32-36.