Администрация гарантирует обеспечение сохранности авторской или согласованной с авторами версии опубликованных в каталоге и на сайте материалов

Каталог A

Авторство и подтверждение авторских прав (регистрация идей)

Способ получения дейтерированного пуринового рибонуклеозида инозина (выход 3.9 г c 1 л ростовой среды) высокого уровня дейтерированности

Предложен метод получения  дейтерированного пуринового рибонуклеозида инозина (выход 3.9 г c 1 л ростовой среды)  высокого уровня дейтерированности (61 % атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий). Метод заключается в выращивании адаптированного к дейтерию штамма Bacillus subtilis – продуцента инозина в тяжеловодородной среде  с 2%-ным гидролизатом биомассы метилотрофной бактерии Brevibacterium methylicum как источника дейтерий-меченых ростовых субстратов (условия получения гидролизата: автоклавирование дейтеро-биомассы в 0.1 н. DСl 30-40 мин при 08 ати). Условия получения дейтерированного инозина: синтетическая тяжеловодородная среда с 99,9%-ной тяжёлой водой (мас.%): глюкоза - 12;D-меченый гидролизат B. methylicum - 2; нитрат аммония - 2; сульфат магния - 1; карбонат кальция - 2. Выращивание бактерий проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой 100 мл) в течение 5-6 сут при 30-320С в условиях интенсивной аэрации.Изотопный состав полученного инозина: 4 ат. дейтерия, 20%; 5 ат. дейтерия, 38%; 6 атомов дейтерия, 28%; 7атомов дейтерия, 14%  с включением дейтерия в рибозный и гипоксантиновый фрагменты молекулы инозина.

 

Во всем мире растет интерес к природным биологически активным соединениям (БАС), меченным стабильными изотопами (D, 13С, 15N,18О и др), незаменимых для многочисленных биохимических и диагностических целей [1], структурно-функциональных исследований [2], а также для изучения клеточного метаболизма [3]. Тенденции к предпочтительному использованию стабильных изотопов по сравнению с радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле спектроскопией 1Н ЯМР [4, 5], ИК- и лазерной спектроскопией [6], а также масс-спектрометрией [7]. Развитие технической и компъютерной оснащенности аналитических методов позволило существенно повысить эффективность проведения биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия БАС на молекулярном уровне [8]. Большое научно-прикладное значение в этом аспекте имеют соединения нуклеиновой природы, содержащие дейтериевую метку в углеродном скелете молекулы [9]. В частности, дейтеро-меченые рибонуклеозиды в ближайшем будущем смогут найти применение в матричных синтезах молекул дейтерированных РНК для изучения их пространственной структуры и конформационных изменений, а также для медицинской диагностики [10].

Важным моментом в исследованиях с применением изотопно-меченых БАС является их доступность. Дейтериймеченые БАС могут быть синтезированы с использованием химических, ферментативных и биосинтетических методов [11, 12]. Однако химические синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят к конечному продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-форм, для разделения которых требуются специальные методы [13]. Более тонкие синтезы меченых БАС связаны с комбинацией химических [14] и ферментативных подходов [15-17].

              Для многих научно-практических целей биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу биосинтетический метод получения дейтериймеченых БАС, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению дейтерия в молекулы и к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений [18]. Традиционным подходом при этом остается предложенный Креспи метод выращивания штаммов-продуцентов в средах с максимальными концентрациями дейтерия [19]. Однако основным препятствием является недостаток дейтеро-меченых ростовых субстратов с высоким уровнем дейтерированности. Прежде всего это связано с ограниченной доступностью и дороговизной самого высокоочищенного дейтерия, выделяемого из природных источников. Природная распространенность дейтерия составляет лишь 0.015% (относительно общего количества элемента), однако несмотря на невысокое содержание дейтерия в пробах разработанные в последние годы методы обогащения и очистки позволяют получать дейтерий-меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты [20].

              Начиная с первых экспериментов американцев Даболла и Кокса по выращиванию природных объектов в тяжелой воде, во всём мире разрабатываются подходы с использованием гидролизатов дейтеро-меченой биомассы как ростовых субстратов для роста штаммов-продуцентов БАС [21, 22]. Однако эксперименты обнаружили бактериостатический эффект тяжёлой воды, заключающийся в ингибировании жизненно-важных функций клетки, оказываемой 40% тяжёлой воды на растительные клетки  [23] и  80-90% тяжёлой воды на клетки простейших и бактерий [24]. Попытки использовать для синтеза в тяжёлой воде природных объектов различной таксономической принадлежности, включая бактерии, микроводоросли [25] и дрожжи [26] предпринимались в течение длительного времени. Однако широкого распространения в биотехнологии они пока не получили ввиду трудности синтеза, использования сложных комплексных ростовых сред, сложности технологической схемы синтеза и т. п. Поэтому целый ряд практических вопросов промышленного биосинтеза дейтерий-меченых БАС в тяжёлой воде остается не решёнными.

Более перспективны схемы синтеза с использованием в качестве дейтерий-меченых ростовых субстратов биомассы метилотрофных бактерий, ассимилирующих метанол по рибулозо-5-монофосфатному (РМФ) и сериновому пути фиксации углерода, интерес к которым возрастает благодаря интенсивному развитию технологии химического синтеза метанола [27, 28]. Уровень ассимиляции биомассы метилотрофов клетками простейших организмов и эукариот составляет 85-98%, а их производительность, измеренная по уровню биоконверсии метанола в клеточные компоненты, достигает 50% [29]. Как было показано нами раннее, метилотрофные бактерии очень неприхотливые объекты, растут на минимальных средах с 2-4% метанолом, в которых другие контаминантные бактерии не размножаются и достаточно легко адаптируются к максимальным концентрациям тяжёлой воды, что существенно для синтеза дейтерий-меченых БАС [30, 31].

Цель идеи заключается в использовании гидролизата биомассы раннее адаптированного нами к тяжёлой воде штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum для получения дейтерий-меченого инозина штаммом продуцентом Bacillus subtilis

Для синтеза D-меченого инозина использовался генетически маркированный штамм грамположительных бактерий Bacillus subtilisпродуцент инозина (предварительно адаптированный к дейтерию селекцией до отдельных колоний на чашках Петри с тяжёлой водой и 2% агаром), который из-за нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых рибонуклеозидов синтезирует в стандартных условиях выращивания (дрожжевая среда, поздний экспоненциальный рост, 32-340С) 17 г инозина на 1 л культуральной жидкости (КЖ) [32]. Максимальный выход инозина достигается при использовании природной протонированной среды, содержащей в  качестве в качестве источников ростовых факторов и аминного азота 2% БВК дрожжей, а в качестве источника углерода и энергии глюкозу (не менее 12 мас.%). Требовалось заменить протонированные ростовые субстраты их дейтерированными микробными аналогами, а также использовать тяжёлую воду высокого уровня изотопной чистоты.

Для решения поставленной задачи использовалась биомасса адаптированного к дейтерию штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum с 50% уровнем биоконверсии метанола (при эффективности конверсии 15.5-17.3 г сух. биомассы на 1 г потребленного субстрата) [33]. Проведение адаптации для B. methylicum определялось необходимостью улучшить ростовые характеристики штамма в максимально дейтерированной среде, поэтому использовали ступенчато-увеличивающийся градиент концентрации тяжёлой воды в ростовых средах в присутствии 2% метанола. Для изучения влияния уровня дейтерированности источника углерода на ростовые параметры протонированный метанол заменялся его дейтерированным аналогом. Согласно полученным данным замена протонированного метанола его дейтерированным аналогом в условиях одинаковой концентрации тяжёлой воды в среде приводила к небольшим уменьшениям ростовых характеристик штамма. Поэтому использовались среды с тяжёлой водой и дейтеро-метанолом. На контрольной протонированной среде с водой и метанолом продолжительность лаг-периода и времени клеточной генерации B. methylicum составили 20 и 2.2 ч, а выход микробной биомассы 200 г с 1 л ростовой среды. В промежуточных опытах биосинтетические параметры изменялись пропорционально концентрации тяжёлой воды. Общая закономерность заключалась в увеличении продолжительности лаг-периода и времени клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы с фиксированием самых низких значений этих параметров в  максимально дейтерированной среде с 98% тяжёлой водой и 2% D-метанолом. За ходом адаптации наблюдали, снимая динамики роста исходного и адаптированного к дейтерию штамма в максимально дейтерированной среде М9, а также по изменению продолжительности лаг-периода, времени генерации и выходов микробной биомассы. В отличие от адаптированного штамма, ростовые динамики исходного штамма в максимальной дейтерированной среде ингибировались дейтерием.

Выход микробной биомассы у адаптированного штамма уменьшался на 13% по сравнению с контрольными условиями при увеличении времени генерации до 2.8, а продолжительности лаг-периода до 40 ч. Адаптированный штамм возвращался к нормальному росту при переносе в протонированную среду после пролонгированного лаг-периода. Улучшенные ростовые характеристики адаптированного метилотрофа существено упрощают схему синтеза дейтеро-меченной биомассы, оптимальным условиям которой удовлетворяет максимально дейтерированная среда М9 с 98% тяжёлой водой и 2% D-метанолом с инкубационным периодом 5-6 сут при 370С.  

Идея получения D-меченого инозина за счёт использования метилотрофных гидролизатов разрабатывалась с учетом способности метилотрофных бактерий синтезировать большое количество белка (выход 50% от веса сухого вещества), 15-17% полисахаридов, 10-12% липидов (в основном, фосфолипиды) и 18% зольных веществ [34]. Гидролиз биомассы проводили автоклавированием в 0.5 н. DCl, чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции обратного (Н-D) обмена в аминокислотных остатках молекул белков. Качественный и количественный состав ароматических аминокислот метилотрофного гидролизата изучали в дейтерированной среде М9 на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) с сульфированной смолой UR-30, а уровни дейтерированности молекул масс-спектрометрией электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот. Гидролизат представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при 440 нм) при выходах аминокислот, сопоставимом с потребностями штамма в источниках углерода и аминного азота. При этом индикатором, определяющим высокую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит высокий уровень дейтерированности молекул аминокислот, который варьирует от 49% для лейцина/изолейцина до 97.5% для аланина.

Биосинтетические характеристики штамма продуцента инозина B. subtilis снимали в протонированной дрожжевой среде с обычной водой и синтетической тяжеловодородной среде с тяжёлой водой и 2% дейтерированным гидролизатом биомассы B. methylicum (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. DСl 30-40 мин при 08 ати), выделенный селекцией (как указано выше) в условиях многостадийной адаптации на твердой среде М9 (2% агар) с 2% D-метанолом со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации тяжелой воды (от 0 до 98%). Состав синтетической тяжеловодородной среды (мас.%): глюкоза - 12; D-меченый гидролизат B. methylicum - 2; нитрат аммония - 2; сульфат магния - 1; карбонат кальция - 2. Выращивание бактерий проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой 100 мл) в течение 5-6 сут при 30-320С в условиях интенсивной аэрации бактерий.  В этих условиях отмечена корреляция в характере изменения ростовых динамик, выхода инозина и ассимиляции глюкозы. Максимальный выход инозина (17 г/л) зафиксирован на протонированной среде при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л. На тяжеловодородной среде выход инозина снижался в 4.4 (3.9 г/л), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л неассимилируемой глюкозы в КЖ.

Полученный результат требовал более кропотливое изучение содержания глюкозы в биомассе штамма после гидролиза, осуществленное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Анализ углеводов осуществляли на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters  К 401 (ФРГ); неподвижная фаза: Separon NH2, 10 мкм; 10 x 250 мм; подвижная фаза: ацетонитрил-вода, (75:25); скорость подачи: 0.6 мл/мин. Смесь гидролизных сахаров составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды (мальтоза, сахароза), а также четыре других неидентифицированных сахара с временами удерживания 3.08 (15.63%), 4.26 (7.46%), 7.23 (11.72%) и 9.14 (7.95%) мин. Выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21.4% от сух. веса, то есть выше, чем фруктозы (6.82%), рамнозы (3.47%), арабинозы (3.69%) и мальтозы (11.62%). Их выхода существенно не отличались от контроля на обычной воде, за исключением сахарозы, не детектируемой в дейтерированном гидролизате.

Далее перед нами встала задача выделения биосинтетически дейтерированного инозина из ростовой среды. Применение сложных физико-химических методов для выделения инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высокой степени хроматографической чистоты. Поскольку в КЖ наряду с синтезируемым продуктом присутствуют примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, а также сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводилось ступенчатое фракционирование КЖ. Повышенная чувствительность инозина к кислотам и щелочам и его нестабильность при выделении диктовали использование кислотных и щелочных растворов низкой концентрации, а также по-возможности проводить выделение при низких температурах, избегая длительного перегрева реакционной смеси. Выделение дейтерированного инозина заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом, твердофазной адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстрактивного извлечения продукта, перекристаллизации и ионообменной хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемператрным осаждением ацетоном при -40С, проводя последующую адсорбцию суммарных рибонуклеозидов активированным углем на холоду. Десорбированные рибонуклеозиды извлекали из прореагировавшей твердой фазы элюцией этанольно-аммиачным раствором при 600С, а сам инозин экстракцией 0.3 М аммиачно-формиатным буфером (рН 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле. Окончательная стадия очистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0.3 М аммиачно-формиатным буфером с 0.045 М хлоридом аммония в условиях изократической элюции с ТСХ контролем при Rf 0.5. Наличие в биосинтетическом образце основной полосы поглощения I, соответствующей нативному инозину (lmax 249 нм, e249 7100 М-1 см-1) и отсутствие вторичных метаболитов II и III доказывает его однородность и тем самым эффективность разработанного метода выделения со степенью хроматографической чистоты 92%. Контроль чистоты проводили методом ТСХ с использованием стандартного набора рибонуклеозидов фирмы Beckman-Spinco (США) на хроматографических пластинках (150 x 150 мм) с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Чехословакия) в системе растворителей: H-бутанол : уксусная кислота : вода, 2 : 1 : 1, об.%. Выход 2.5 г/л (64%). Т. пл. 68-700С. [a]D20 1.610 (с 1.5 этанол). Rf  0.5. рКa 1.2 (фосфатный буфер, рН 6.87). УФ-спектр (0.1 н. НСl) (lmax 249 нм, e249 7100 М-1см-1).

Уровень дейтерированности инозина исследовали методом масс-спектрометрии FAB на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США), снабженным цезиевым источником Cs+ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА из за высокой чувствительности, позволяющей детектировать 10-8-10-10 моль вещества в пробе, что существенно выше чем при использовании 1Н ЯМР-спектроскопии [7]. FAB-спектр 2Н-меченного инозина: (глицериновая матрица Cs+, ускоряющее напряжение 5 кВ, ионный ток 0.6-0.8 мА): (M+H)+ m/z (I,%): 273, 20% (4 ат. 2Н); 274, 38% (5 ат. 2Н); 275, 28% (6 ат. 2Н); 276, 14% (7 ат. 2Н), (А + H)+ 136, 46%; (Б + Н)+ 138, 55%; (Б - НCN)+  111, 49%; (В - HCN)+  84, 43%.  

Пути фрагментации молекулы методом FAB приводят к распаду инозина на фрагмент рибозы А с Мr при массовом соотношении m/z 133 и гипоксантиновый фрагмент Б c Мr m/z 136 (их распад сопровождался миграцией протона Н+), который в свою очередь расщепляется на ряд менее низкомолекулярных осколочных фрагментов ВГДЕ и Ж при m/z 109, 108, 82, 81 и 54 за счет элиминирования НСN и СО из гипоксантина.

Полученный биосинтетически дейтерированный инозин представлял смесь изотопнозамещенных форм молекул с различным количеством атомов водорода, замещенных на дейтерий. Подсчет уровня дейтерированности молекулы инозина определяли, сравнивая величины пиков молекулярных ионов Мr инозина дейтерированного и протонированного образцов (формирование пика молекулярного иона инозина сопровождалось миграцией протона Н+). Пик (М+Н)+ полиморфно расщеплялся на отдельные кластеры с примесью молекул со статистическим набором массовых чисел m/z с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности с включением четырех (m/z 273, 20%),  пяти (m/z 274, 38%), шести (m/z 275, 28%) и семи атомов дейтерия  (m/z 276, 14%). Суммарный уровень дейтерированности молекулы (УД) составил 61% от общего количества атомов водорода в углеродном скелете молекулы.

Масс-спектрометрический анализ FAB выявил включение атомов дейтерия в рибозный и гипоксантиновый фрагменты молекулы, что подтверждено присутствием двух “тяжелых” пиков фрагментов рибозы А m/z 136, 46% (вместо m/z 133, 41%)  и  гипоксантина Б m/z 138, 55% (вместо m/z 136, 48%), а также пиков низкомолекулярных фрагментов, продуктов распада гипоксантина В m/z 111, 49% (вместо m/z 109, 45%) и Гm/z 84, 43% (вместо m/z 82, 41%). Эффект множественного мечения определяется самим способом получения дейтерированных молекул и свидетельствует о недостаточно высокой селективности биосинтетической схемы, повысить которую возможно контролем изотопного состава синтетической ростовой среды и исключения источников всех дополнительных протонов, попадающих в ростовую среду из кристаллогидратов солей. Согласно разработанному методу можно получить 4 грамма дейтерированного инозина с 1 литра ростовой среды, который может быть использован в матричных синтезах РНК, в медицинской диагностике и клинических исследований.   

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Young V.R., Yu Y.M., Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes 15N, 13C, and 2H as probes. in: New techniques in nutritional research // Whitehead R. G. (ed). Acad. Press. N. Y. 1990. V. 9. Р. 17-72.

2. Hruby V.J. // Synth. and Appl. Isot. Label. Compounds. 1985. V. 4. N 1. Р. 287-292. 

3. Nelson J.E., Ruo T.I. // Clinica Chemica Acta. 1988. V. 175. N 3. Р. 59-65.

4. Stockman B.J., Reily M.D., Westler W.M., Ulrich E.L., Markley J.L. // Biochemistry. 1989. V. 28. N 7. Р. 230-236.

5. McIntosh L.P., Dahlquist F.W. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. N 1. Р. 1-38.

6. Argade P.V., Rothschild K.J., Kawamoto A.H., Herzfeld J., Herlihy W. C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78 3. P. 1643-1646.

7. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. N 10-11. С. 856-869.

8. Darmaun D., Robert J. J., Bier D.M., Mathews D.E., Young V.R. // Annales-d’ Endocrinologie. 1985. V. 46. N 4. Р. 355-356. 

9. Shvets V.I., Yurkevich A.M., Mosin O.V., Skladnev D.A. // Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V. 8. N 4. P. 231.

10. Fesik S.W., Zuderweg E.R.P. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. № 2. Р. 97-131.

11. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. //Биотехнология. 1996. № 10. С. 24-40.

12. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. N 3. С. 163-178.

13. Daub G. H. Syntheses with stable isotopes. in: Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference // Klein E. R. (ed). Academic Press. N. Y. 1979. Р. 3-10.

14. van der Berg E.M.M., van Liemt, Willem B.S // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. N 9. Р. 304-313.

15. Walker T. E., Matheny C. // J. Org. Chem. 1986. V. 51. Р. 1175-1179.

16. Фалеев Н.Г., Рувинов С. В., Сапоровская Н. В., Беликов В. М., Закомырдина Л.Н. // Изв. Ан. СССР. Сер. хим. 1989. Т10.  Вып. 3. С. 2341-2343.

17. LeMaster D. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. N 2. Р. 133-174.

18. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. V. 62. N 2. P. 225-229.

19. Crespi H.L., Marmur J., Katz J.J. // Nature. 1962. V. 84. N 1. Р. 3489-3491.

20. Crespy H.L. Stable Isotopes in the Life Sciences. International atomic energy agency Press. Vienna. 1977. Р. 111-121.

21. Daboll H.F., Crespi H.L., Katz J.J. // Biotechnol. Bioengineer. 1962. V. 4. N 5. Р. 281-297.

22. Cox J., Kyli D., Radmer R. // Trends Biotechnol. 1988. V. 6. № 12. Р. 279-282.

23. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. // Изв. РАН. Сер. биол. N 3. С. 1-10. 

24. Thomson J. F. Biological effects of deuterium. Pergamon Press. N. Y. 1963. P. 1-133.

25. Еремин В.А., Чекулаева Л.Н., Харатьян Е.Ф., Островский Д.Н. // Микробиология. 1978. Т. 32. Вып. 4. С. 629-636.

26. Busujima U.K., Shimiba S., Narita K., Okada S. // Chem. Pharm. Bull. 1988. V. 36. N 4. P. 1828-1832.

27. Colby J, Dalton H. // Ann. Rev. Microbiol. 1979. V.33. N 6. P.481-517.

28. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D.// Amino Acids. 1994. V.6. N 2. P.165-176.

29. Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. Convertion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass, in: 6 th Eur. Conf. of Biomass for Energy. Athens. Greece, 1991. P. 234.

30. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.

31. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.

32. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская К.А., Складнев Д.А., Чеботаев Д.В., Юркевич А.М., Швец В.И. // Биотехнология. 1996 г. № 4. C. 19-27.

33. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б.,Складнев Д.А., Акимова О.Л. // Биотехнология. 1993. № 9. С. 16-20.

34. Зорина А.В, Бабусенко Е.С. Химический состав биомассы метилотрофных бактерий. Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов. // Тезисы докл. молодых ученых. Рига. 1987. Т. 1. № 2. С.35-40.

Личный кабинет

Логин
Пароль
Регистрация Забыли пароль?

От администрации сайта

  • Обращение администрации

    Уважаемые авторы и посетители, Вам представлена новая версия сайта. На сайте проводятся работы, возможны некорректные отображения информации и ошибки. В случае обнаружения недостатков просим сообщать по электронной почте.

  • Необходимость новой регистрации для авторов

    Уважаемые авторы!
    Убедительно просим Вас осуществить регистрацию на новом сайте. После регистрации, через 2-4 дня, Вы получите доступ к личному офису с расширенным спектром сервисов.

Новости от авторов

  • Новое направление обучения техникам живописи

    Художественно-педагогическое синтетическое инновационное направление представляет собой совокупность обучения техникам и технологии станковой живописи, совмещенное с погружением в техники освоения метафизического мира космических связей порядка «нисхождения корней», обусловленного связью причины и следствия и подчиняющегося Абсолютным Законам. Смотрите публикацию A4В015.

  • Метатеория фундаментальных физических теорий

    Опубликованная теория представляет целостную научную картину мира, как концептуальную логическую модель в виде диаграммы Эйлера - Венна, которая является обоснованием математической структуры физических законов, как области целостности в поле рациональных чисел. Смотрите публикацию A1В051.